苏茹月 1 黄容 2 吴燕雨 2 张娟(通讯作者)2* 河南省疾病预防控制中心,河南 郑州 450016; 2. 南华大学药学院,湖南 衡阳 421001

　　作者简介:苏茹月(1992 年 6 月 -),女,河南商丘,硕士。研究方向:粟酒裂殖酵母线粒体功能的研究。

　　基金项目:湖南省教育厅科学研究项目(项目编号:19C1578)

　　摘要:多蛋白复合体(MPCS)是蛋白质在体内行使功能的重要形式之一。蓝色温和非变形聚丙烯凝胶(BN-PAGE)是一种依赖于考马斯亮蓝 G250 染料给蛋白质带上负电荷的非变性蛋白的分离方法,是研究蛋白质复合体最强有力的方法之一。本文运用 BN-PAGE 技术来研究粟酒裂殖酵母线粒体蛋白复合体,利用 BN-PAGE 和 western blot 方法技术相结合对粟酒裂殖酵母线粒体蛋白复合体进行鉴定。本次研究选择粟酒裂殖酵母线粒体蛋白 Ppr10 作为研究对 象,实验结果表明,粟酒裂殖酵母线粒体蛋白 Ppr10 的缺失影响了线粒体复合体及超复合体的组装。

　　关键词:粟酒裂殖酵母;线粒体;多蛋白复合体;BN-PAGE;Ppr10

　　前言

　　本研究通过借鉴在芽殖酵母或哺乳动物中的 BN-PAGE 实验方法来摸索适用于粟酒裂殖酵母中的条件,进而探讨粟酒裂殖酵母中 Ppr10 蛋白的缺失是否影响线粒体呼吸链复合体及超复合体的组装导致线粒体呼吸链功能受损,这为更好地研究粟酒裂殖酵母线粒体蛋白功能提供技术支持和理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料与仪器

　　粟酒裂殖酵母野生型菌株 yHL6381,以及本实验室构建突变体菌株 Δppr10 保存在 -80°C冰箱,Bis-Tris,三甲基甘氨酸,Serva Blue G-250,6- 氨基己酸,甘氨酸,去垢剂十二万基麦芽糖甘和洋地黄皂苷,抗体购自南京金斯瑞 , 过硫酸铵购自上海生工,实 验用水来自 Milli-Q 纯水系统,ECL PLUS 显色液,超速离心机,梯度混合仪,小转子,蠕动泵。

　　1.2 方法

　　1.2.1 线粒体蛋白制备

　　挑取活化好的野生型菌株yHL6381,以及突变株 Δppr10,接种在 YES 液体培养基中 30 °C振荡培养,离心收菌。超纯水洗菌一次,接着用 S buffer 缓冲液洗涤一次,加入溶菌裂解酶裂解酵母细胞壁 ,4°C离心收菌,加入菌体 4 倍体积的匀浆缓冲液吹打混匀,然后将菌液转移到 Dounce 匀浆器中,将 Dounce匀浆器置于冰中 ,d o u n c e 1 5 - 2 0 次 ,离心 取上清 ,4 ° C ,1 2 0 0 0 g ,离心 30 min,弃上清,保留沉淀,将沉淀溶解在 SEM buffer 中,即为线粒体蛋白提取液,保存于 -80°C冰箱 [1]。

　　1.2.2 非变性梯度胶制备

　　用梯度混合仪分别灌制 3% ~ 12% 和 5% ~ 10% 的分离胶,室温冷却 1-1.5h,待分离胶凝固之后再灌制 4% 的浓缩胶,放 30°C 30 min 使凝胶充分胶联。

　　1.2.3 线粒体蛋白处理

　　取yHL6381,Δppr10菌株线粒体蛋白粗提取液,4°C 12000rpm 离心 15min,并用 1mg/mL 的 3×Gel buffer 重悬,并添 加终浓度为 1mM PMSF 和 5mM MgCl2,再次 4°C 15300g 离心 30min, 弃上清,添加终浓度为 2% 的去垢剂,充分混匀,并放置在 4°C 30 min。4°C,15300g 离心 5min,将得到的上清取出 3uL 用来测浓度。将离心得到的上清放在 -80°C保存,上清添加 BN sample buffer 使终浓度为 0.25%。

　　1.2.4 上样

　　取 120ug 样品加入 2uL BN sample buffe 充分混匀后上样。

　　1.2.5 电泳

　　将处理好的样品用微量注射器加入上样孔中,倒入 1× 阴 极缓冲液 A;盐酸调整溶液 PH=7.0,添加 0.02% 和阳极缓冲 液,4°C,恒压 80V 开始电泳,待电泳进行到凝胶的 1/3 处时将阴极缓冲液 A 更换成阴极缓冲液 B,将电压调整到 150V,整个电泳过程电流控制在 50 mA 左右,电泳过程中应避免产生较多 的热量。

　　1.2.6 BN-PAGE 考马斯亮蓝染色

　　BN-PAGE 凝胶电泳结束后,一方面可用于考马斯亮蓝染色,另一方面可用于westernblot。取出BN-PAGE凝胶,加入考马斯亮蓝染色液,缓慢震荡染色 30 min,回收考马斯亮蓝染液,加入脱色液洗涤到胶棉呈现清晰的条带为止,拍照。

　　1.2.7 BN-PAGE western blot

　　取出 BN -PAGE 凝胶,放入转膜缓冲液。转膜的条件为 150mA,90min,冰上进行。洗膜,倒入封闭液,20 rpm 封闭 1.5-2h。洗膜,敷一抗。在一抗孵育快结束时配制化学二抗,按 1:2000 加入化学二抗,20 rpm,室温孵育1h。洗膜,将膜放在化 学发光仪器,曝光显色。

　　2 结果

　　2.1 芽殖酵母和裂殖酵母复合体 III/IV 亚基组成分析

　　线粒体氧化磷酸化需要通过镶嵌在线粒体内膜的 5 个复合体来进行,即复合体 I,复合体 II,复合体 III,复合体 IV,复合体 V,这五个复合体在人类细胞中非常保守。在芽殖酵母中没有复合体 I,而是有 3 个 NADH 脱氢酶取代。而在粟酒裂殖酵母却是相对保守,只有复合体 III,复合体 IV,复合体 V。这些复合体之间也可以形成超级复合体比如III2+IV2,III2+IV1 或 Vn,又或者是这些复合体之间会形成二聚体III2 或 IV2。裂殖酵母复合体 III 预测相对分子量为 219.34kDa,复合体 IV 预测相对分子量为 219.61kDa,这些只是预估复合体相对分子量大小,但是实际上要比预估的分子量大,这些分子量有助于分析超复合体的组成。

　　2.2 不同去垢剂对 BN-PAGE 实验结果的影响

　　分别用 DG 和 DM 处理粟酒裂殖酵母线粒体样品会得到不同的蛋白复合体。参照芽殖酵母中超复合体蛋白的亚基大小,对粟酒裂殖酵母中超复合体蛋白进行初步的标记,DG 处理粟酒裂殖酵母线粒体会得到 2 个超复合体,而 DM 处理粟酒裂殖酵母线粒体会得到超复合体 III。不同的去垢剂处理线粒体会得到不同复合体。

　　2.3 Western blotting 检测 DG 处理 Δppr10 线粒体后的 结果

　　对比野生型菌株 yHL6381,用 Cox1 抗体检测时,发现 Δppr10 菌株中的超复合体 III2+IV 和复合体 IV 显著降低;用 Atp9 抗体检测时,复合体 V 出现较大的降低,而复合体 Vn 降低不明显;用 Cob1 抗体检测时,超复合体 III2+IV1 急剧降低,超复合体 III2 也出现显著降低。以上结果表明,Ppr10 蛋白的缺失对线粒体超复合体 III2+IV/IV/V/III2+IV1/III2 的组装有严重的影响,对复合体 Vn 的组装有轻微的影响。

　　2.4 Western blotting 检测 DM 处理 Δppr10 线粒体后的结果

　　在梯度胶5%-10%电泳,对比野生型菌株yHL6381,用 Cox1 抗体检测时,发现 Δppr10 菌株中的复合体 IV 显著降低;用 Atp9 抗体检测时,复合体 V 出现较大的降低;用 Cob1 抗体检测时,复合体 III 出现显著降低。上述结果表明,Ppr10 蛋白的缺失对线粒体复合体 III/IV/V 的组装有严重的影响。

　　3 讨论

　　本文主要通过 complexIII 的亚基 Cob1 进行抗体检测复合体组装,根据考马斯亮蓝条带染色结果表明,不同浓度梯度胶以及不同去垢剂的处理都会影响电泳结果,因此我们要选用合适的去垢剂浓度从而分离得到不同分子质量大小的复合体。实验结果表明去垢剂的浓度在 2% 有利于保护复合体的稳定性。另外,用不同的去垢剂处理线粒体蛋白,会得到不同的蛋白超复合体。BN- PAGE 方法在研究蛋白质相互作用中具有很大的优点,但是在线粒体蛋白样品提取以及电泳分离纯化等方面需要不断优化 [2-3],且 在粟酒裂殖酵母中应用较少,本研究为 BN-PAGE 在研究粟酒裂殖酵母线粒体蛋白复合体及超复合体奠定了基础。

　　本研究能够证明粟酒裂殖酵母中 Ppr10 对线粒体蛋白复合体的组装很重要。发现 Ppr10 蛋白的缺失会影响线粒体蛋白会严重影响复合体 III/IV/V 和超复合体 III2+IV/IV/V/III2+IV1/III2 的组装,对复合体 Vn 的组装影响较小。本研究阐明了 Ppr10 是通过影响线粒体复合体的组装来影响线粒体蛋白的翻译和合成受损,进而导致 Ppr10 敲除菌在非发酵培养基上表现出生长缺陷的表型。因此,本文对研究 Ppr10 在粟酒裂殖酵母中的功能具有重要的意义。

　　Ppr10 有两个模体,并且模体的缺失会导致粟酒裂殖酵母菌株出现线粒体呼吸缺陷表型。因此,接下来可以进一步研究 Ppr10 蛋白的两个模体会在线粒体蛋白复合体的组装中发挥的作用。

　　参考文献:

　　[1] 李琴 . 粟酒裂殖酵母 Ppr10-Mpa1 复合体的制备 [D]. 南京师范大学 ,2019.

　　[2] 张娟 . 粟酒裂殖酵母中 ppr 基因缺失引起细胞絮凝的机制研究 [J]. 微生物学杂志 ,2019,39(02):11-17.

　　[3] 闫建华 . 粟酒裂殖酵母中 PPR 蛋白 Ppr10 与 Mpa1 相互作用的研究 [D]. 南京师范大学 ,2016.