吴 欢 铜仁市检验检测院 554300

　　摘要:本文研究了固相萃取浓缩净化—气相色谱检测法(GC)测定乳与乳制饮品中 C18H34O2(游离脂肪酸)含量。样品利用石油醚·乙醚萃取法(第一法)及叔丁基甲醚·正己烷萃取法(第二法)两种前处理方法进行脂肪酸的提取,固相萃取柱进一步净化,使用氢氧化钾甲醇酯化,应用气相色谱法 - 氢火焰离子化检测器(FID)测定。

　　结果显示,在 0.01mg/mL ~ 0.04mg/mL 浓度范围内,峰面积与浓度呈良好线性关系,r > 0.999。在 0.005、0.01、0.02mg/mL 添加水平,第一法样品平均回收率为 87.20% ~ 107.10%,相对标准偏差为 2.22 ~ 4.00, 第二法样品平均回收率为 85.6% ~ 97.1%, 相对标准偏差为 2.38 ~ 5.00,回收率比第一法略低。研究表明,二种方法均适用于乳制饮品中游离脂肪酸的测定,具有快速、定量准确、检测灵敏等优点。

　　关键词:乳制饮品;脂肪酸;测定方法;对比

　　1. 材料与方法

　　1.1 实验材料与试剂

　　1.1.1 仪器和设备

　　气相色谱仪(配有 FID 检测器),Agilent Technologies;旋转蒸发仪 RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;电热恒温水浴锅,上海跃进医疗器械有限公司;自动快速浓缩仪 DSY- II 型,北京金科精华苑技术研究所。

　　1.1.2 试剂

　　冰醋酸、石油醚、乙醇、无水硫酸钠、乙醚、石油醚、氯化钠、氢氧化钾(国药集团化学试剂有限公司);正己烷、三 氟化硼甲醇、二氯甲烷、异丙醇、叔丁基甲醚、甲醇(美国 TEDIA 科技公司)。

　　1.2 实验操作与步骤

　　1.2.1 提取样品脂肪制备

　　(1) 石油醚·C4H10O 提取脂肪法

　　牛奶、 酸牛奶等液态试样:称取10g(精确到0.1mg)试样于抽脂管中,待测。

　　奶酪、奶粉固态试样:称取试样 1.0g(精确到 0.1 mg)至抽脂管中,加入 65±1°C的水 10 mL 溶解试样,振摇,使样品完全分散。

　　于上述试样中加入 2 mL 氨水,于 65±1°C水浴锅中放置15min,取出轻摇,冷却至室温。 在制备好的样品中加入10mLC2H6O,混匀。加入 25 mLC4H10O,加塞振摇 1min。加 入 25mL 石油醚,加塞振摇 1min,静置、分层,有机层转入磨口烧瓶中。再加入 25mLC4H10O 及 25mL 石油醚,加塞振摇 1min,静置、分层,有机层转入磨口烧瓶中,再重复操作一次。合并抽提液于磨口烧瓶中,用旋转蒸发仪浓缩至干。

　　(2) 叔丁基甲醚·正己烷提取脂肪法

　　牛奶、酸牛奶等液体样品,称取 10g( 精确到 0.01mg) 置于 50mL 的离心管中,加入 10mLC2H6O、1mLH2SO4(2.5mol/L)。

　　奶酪:称取 1g(精确到 0.01mg) 奶酪,用无水 Na2SO4 进行碾碎,加入 0.3mLH2SO4(2.5mol/L)。

　　奶粉:称取 1g(精确到 0.01 mg)奶粉,加入 65±1°C 的 水 10mL 溶解试样, 振摇, 使样品完全分散,加入10mLC2H6O、1mL H2SO4(2.5mol/L)。

　　1.2.2 分析步骤

　　(1)浓缩

　　在 60°C水浴情况下,旋转蒸发至近干,接着在 60°C下氮气吹干。

　　(2)游离 C18H34O2 的收集

　　过氨基柱

　　活化:加入 3ml 二氯甲烷·异丙醇 (2:1) 和3mL 叔丁基甲醚·正己烷(1:1)使柱子活化。

　　上样:在样品中加入 3mL 叔丁基甲醚·正己烷(1:1)( 重复3次 )震荡,将样品溶于其中,吸入柱内。

　　洗脱:加入6mL 二氯甲烷·异丙醇 (2:1)(重复2次)洗脱结合态的 C18H34O2。

　　收集:用 2% 醋酸叔丁基甲醚 3mL 进行洗脱(重复2次),用圆底磨口烧瓶进行收集,使游离 C18H34O2 洗脱出。

　　将其用旋转蒸发仪进行转干。

　　(3)皂化酯化

　　浓缩干燥之后再加入 10 mL 氢氧化钾甲醇溶液置于 80±1°C水浴上回流 10 min。再加入 5 mL 三氟化硼甲醇溶液,继续回流 15min,冷却至室温。

　　(4)进样

　　拿出后静置冷却后,倒入 50mL 离心管中,以饱和氯化钠溶液洗净瓶内残留物,每次 3mL,一共洗四次。用移液管吸取 10mL 正己烷进入离心管中,盖上管盖,混匀,以 5000 转 / 分钟的速度,离心 5 分钟。离心完毕后,取上层有机相 2mL 进进样瓶,待气相色谱用。

　　1.2.3 仪器参数与测定条件

　　色谱条件:

　　色谱柱:SP-2560(聚二氰丙基硅氧烷强极性固定),柱长 100m,内径 0.25mm,膜厚 0.20μm。

　　载气:氮气。 载气流速:1.0 mL/min。

　　进样口温度:260°C。分流比:30:1。

　　检测器温度:280°C。

　　柱温箱温度:初始温度 140°C,保持 5min,以 4°C /min 升温至 240°C,保持 15min。

　　1.2.4 气相定性定量分析

　　外标法定量。根据样液中被测游离 C18H34O2 含量情况,选定浓度相近的标准工作溶液。标准工作溶液和待测液中游离C18H34O2 的响应值在仪器检测的线性范围内。对标准工作溶液和待测液等体积参插进样测定。待测样品与标准样品的峰值直接比较计算样品含量。

　　试样中游离 C18H34O2 的含量按公式(1)计算

　　式中:

　　As —试样溶液中游离 C18H34O2 的峰面积;

　　Astd—标准工作液中游离 C18H34O2 的峰面积;

　　Cstd—标准工作液中游离 C18H34O2 的浓度,单位为微克 每毫升(mg/mL);

　　V —溶解试样或浓缩后所定容的体积,单位为毫升(mL); m —试样的称样量,单位为克(g);

　　f —校正因子。

　　1.2.5 标准曲线的绘制

　　由于牛乳中豆蔻酸、棕榈酸及硬脂酸的含量分别为 8%~ 14%,22% ~35%,9%~ 14%,3 种 C18H34O2 可占到 C18H34O2 总量的 60%以上。

　　以正己烷为溶剂,配成肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)含量分别为 0.010、0.015、0.020、0.0275、0.04mg/mL 的标准系列, 在规定的色谱条件下进行测定。在优化的 GC 分析条件下进样 20μL,按公式(2)进行计算,并以样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

　　按式 (1) 计算工作曲线的回归方程:

　　Y=m·C+b (2)

　　式中:

　　Y -C18H34O2 的峰面积; C -C18H34O2 浓度,mg/mL; m - 线性回归方程斜率。b - 线性回归方程截距; 1.2.6 精密度实验取各样品均为 10g,按照优化的 GC 分析条件进行测定,同一天重复进样 6 次,记录峰面积值,并计算标准偏差和相对 标准偏差,考察其重现性。

　　1.2.7回收率实验

　　为了评价方法的准确度,本实验对样品分别进行了0.005、0.01、0.02mg3 个浓度的肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)加标回收,加标回收实验,每种样品取四份,一份作为样品本底,其余加入标准工作液不同浓度后,按样品前处理方法处理后进样 20μL,以测得的峰面积比计算平均回收率。

　　2. 结果与讨论

　　2.1 前处理方法的选择

　　2.1.1 提取剂的选择

　　采用石油醚·C4H10O 提取法及叔丁基甲醚正己烷提取法。对于第一种方法是由氨水—C2H6O 破坏脂类和非脂成分的结合,再用石油醚 C H O 进行提取。

　　C4H10O 的沸点低,C4H10O 溶解脂肪的能力比石油醚强。现有的脂肪含量的标准分析法都采用 C4H10O 做提取剂。但 C4H10O 约可饱和 2% 的水分,含水的 C4H10O 也将同时抽出糖分等非脂类成分,所以,实用时必需采用无水 C4H10O 做提取剂,被测样品必须事先烘干。石油醚具有较高的沸点,它没有胶溶现象,不会夹带胶态的淀粉、蛋白质等物质。石油醚抽出物比较接近真实的脂类。

　　而第二种方法是有硫酸—C2H6O 破坏脂类和非脂成分的结合,再用叔丁基甲醚·正己烷进行提取。由于样品中的乳类脂肪中的脂肪球被乳中酪蛋白钙包裹,又处于高度分散的胶体分散系中,故不能直接被提取剂提取 ,需先用碱或酸处理后再进行提取。

　　2.1.2 净化方法的选择

　　在收集游离 C18H34O2 时,本文采用了过氨基小柱 (NH2), 它具有极性固定相和弱阴离子交换剂,可通过弱阴离子交换 ( 水溶液 ) 或极性吸附 ( 非极性有机溶液 ) 达到保留作用,所以适用于水溶液样品中碳水化合物弱阴子和有机酸化合物。通过实验发现,此种方法其溶剂使用量少、操作简单、且能很好的将游离 C18H34O2 洗脱出。

　　2.2 检出限和线性范围

　　通过数据总体看来,在回收率上,第一种方法对于棕榈酸(C16:0)及硬脂酸(C18:0)效果比较理想,平均要比第二种方法上高出 5 ~ 10% 左右,通过石油醚 C4H10O 的连续萃取,是 C18H34O2 能很好的被提取,第二种方法的测定,对于肉豆蔻酸(C14:0)的回收率较为理想可稳定于 90% 左右,二种方法的回收率及 RSD 均符合游离 C18H34O2 的检测要求及方法的建立。

　　2.3 两种前处理法对于不同乳制饮品进行游离 C18H34O2 含量测定

　　从市场上销售的乳制饮品中挑选了四种常见的品种(牛奶、酸牛奶、奶酪、奶粉),通过对四种不同的乳制饮品进行检测其游离 C18H34O2,从中来探讨不同乳制饮品中游离 C18H34O2 的含量及组成成分以及两种方法测出的结果。

　　2.3.1 石油醚·C4H10O 提取脂肪法

　　将四种不同的乳制饮品,通过第一种方法进行前处理,净化及甲酯化,最后用气相色谱仪进行测定结果发现,四种不同的乳制饮品中,其中奶酪的游离 C18H34O2 为最多有 105.13 mg/100g,其次为奶粉和牛奶,酸奶中游离 C18H34O2 为最少仅有 1.78mg/100g。

　　一般液态奶的脂肪含量在 3 ~ 5%,奶粉的的脂肪含量不得低于 26% 以及奶酪的脂肪含量不得低于 25%,而酸奶中的 脂肪含量为 0.5 ~ 1.2% 左右。

　　由于在工艺上,酸奶通过发酵后,降解了一些脂肪和蛋白质的作用,乳酸菌发酵乳糖生成乳酸菌时,引起pH下降,延长了产品的保存时间。

　　奶粉通过喷雾干燥之后,采用二级均质法,能很好的降低游离 C18H34O2 含量。

　　奶酪是以蛋白质和脂肪为主要成分含有少量无机盐、乳糖、维生素等的乳制饮品。100 份原料乳大致只能生成10份 奶酪,即等于将原料中的主要成分蛋白质和脂肪浓缩了 10 倍。通过长期的发酵也会产生更多的游离C18H34O2。

　　牛奶样品中游离 C18H34O2 组成成分及占比分别是:肉豆蔻酸(C14:0)7%、棕榈酸(C16:0)47%、硬脂酸(C18:0)19%、其 它 27%。

　　酸牛奶样品中游离 C18H34O2 组成成分及占比分别是:肉豆蔻酸(C14:0)4%、棕榈酸(C16:0)30%、硬脂酸 (C18:0)10%、其它 56%。

　　奶酪样品中游离 C18H34O2 组成成分及占比分别是:肉豆蔻酸 (C14:0)5%、棕榈酸(C16:0)36%、硬脂酸(C18:0)16%、其它43%。

　　奶粉样品中游离 C18H34O2 组成成分及占比分别是肉豆蔻酸 (C14:0)4%、棕榈酸(C16:0)41%、硬脂酸(C18:0)14%、其它 41%。

　　由以上数据发现,在各种游离 C18H34O2 占有比例上,其中棕榈酸(C16:0)为最多可占总游离 C18H34O2 总量的 40 ~ 60%,其次为硬脂酸(C18:0)可占 10 ~ 20% 左右,相比较而言,肉豆蔻酸(C14:0)所含的量为最低,只占 6 ~ 10%。

　　其棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、豆蔻酸(C14:0)三者的总含量可达总游离脂肪总量的 50~90%,可以说在乳制饮 品中的游离 C18H34O2,其三者占有很大比例。

　　同时可以看出,在牛奶中游离脂肪的种类并不多,其中,棕榈酸(C16:0)、 硬脂酸(C18:0)、豆蔻酸(C14:0) 三者为主要成分。

　　当然,也可能由于本身牛乳中豆蔻酸、棕榈酸及硬脂酸的含量分别为 8%~ 14%,22%~ 35%,9%~ 14%,3 种 C18H34O2 可占到 C18H34O2 总量的 60%以上。所以,在游离 C18H34O2 中其三者的量也占了大部分。

　　奶酪与牛奶色谱图相比,多了 C18:1N9C(油酸)和 C18:2N6C( 亚油酸 ),各游离酸明显增多。

　　2.3.2 叔丁基甲醚·正己烷提取脂肪法将四种不同的乳制饮品,通过第二种方法进行前处理,净化及甲酯化,最后用气相色谱仪进行测定,结果可见表 1。 此次的方法所测得的结果整体上略小于石油醚 C4H10O提取法的结果。

　　利用二种前处理方法测定同种品牌的同种商品,相比较而言,采用石油醚·C4H10O 提取的样品中测出的数据略大于叔丁基甲醚·正己烷提取法的数据,基本上差距在 10% ~ 20% 左右。

　　从表 3 中也可发现,四种乳制饮品其游离 C18H34O2 含量从低到高有明显的不同,在两种方法的结果比较中也可看出第一种方法对于牛奶、酸奶、奶酪和奶粉测定中游离 C18H34O2 都明显高于第二法,所以,无论是在游离 C18H34O2 多或少的样品中,第一法的结果都略显高于第二法。

　　第一种方法采用氨水—C2H6O 溶液破坏乳的胶体性及脂肪球膜,使非脂成分溶解于氨水—C2H6O 溶液中,而脂肪游离出来,再用 C4H10O—石油醚提取出脂肪,效率比较高,而第二种方法利用硫酸—C2H6O 溶液进行水解,随后用叔丁基甲醚·正己烷通过几次离心进行萃取。

　　在第一种方法中用石油醚 C4H10O 连续几次萃取并用通过震荡法采取提取,通过连续几次的提取后,能更好的将脂肪溶解在石油醚 C4H10O 中,并且在实验操作中,因为C4H10O 溶解脂肪的能力比石油醚强,所以在第一次提取时,先放 C4H10O 在放石油醚能达到更好的效果。

　　3. 结论

　　本文研究了含有游离脂肪酸的乳与乳制品的前处理方法,采用石油醚·乙醚提取法及叔丁基甲醚·正己烷提取法。石油醚·乙醚提取法(第一法)是由氨水—乙醇破坏脂类和非脂成分的结合,再用石油醚·乙醚进行提取。而叔丁基甲醚·正己烷提取法(第二法)是由硫酸—乙醇破坏脂类和非脂成分的结合,再用叔丁基甲醚·正己烷进行提取。通过实验发现,第一法比第二法提取的游离脂肪酸更多。

　　在对两种前处理方法进行线性及回收率测的实验中可得出 : 在 0.01mg/mL-0.04mg/mL 浓度范围内,峰面积与浓度呈良好线性关系,r>0.999。在 0.005、0.01、0.02 mg/mL 添加水平,第一法样品平均回收率为 87.20%-107.10%,相对标准偏差为 2.22-4.00,第二法样品平均回收率为 85.6%- 97.1%,相对标准偏差为 2.38-5.00,回收率比第一法略低。

　　综上所述,二种方法均适用于乳制品中游离脂肪酸的测定,具有快速、定量准确、检测灵敏等优点,相比较而言,石油醚·乙醚提取法的回收率略高。

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