曹建宏 舒世平 张艳 * 曹海阔 谭立杭 香格里拉酒业股份有限公司 云南迪庆 674412

　　作者简介:曹建宏(1977.11-),男,汉族,陕西凤翔,硕士研究生,高级农艺师、高级工程师。研究方向:酿酒葡萄种植与新产品研发 通讯作者简介:张艳 (1982-), 女,专科,研究方向:贵腐葡萄酒

　　科技项目:云南省科技厅支持三年行动计划《香格里拉高原酿酒产区贵腐酒的研究与开发》资助([2017]DC012)。

　　摘 要:研究在香格里拉高原产区的贵腐葡萄基地,成功筛选并分离本土贵腐菌13#贵腐霉菌(灰绿葡萄孢)。研究以霞多丽葡萄为原料,通过人工接种贵腐菌的方法获得贵腐葡萄,进一步评价人工酿造贵腐霞多丽葡萄酒技术的可行性。研究使用顶空固相微萃取气质联(GC-MS)分析人工贵腐酒和晚采浓甜葡萄酒(对照)的香气成分和香气特征。结果显示,人工贵腐酒一共检测到了48种香气物质,对照检测到了67种。分析发现,人工贵腐酒含有更多种类的6类香气化合物,具有典型的9种类型香气成分。增加了葡萄酒更加丰富和复杂的香气特征。

　　关键词:香格里拉产区;灰葡萄孢;贵腐酒;香气成分

　　云南迪庆香格里拉高原处于高海拔、低纬度地区,紫外线辐射强,空气清新,降雨少,具有砾石沙质土壤通透性好,有机质含量高,冬季无需埋土等生态条件特点,选取符合贵腐霉菌适合生长的小产区建立贵腐葡萄酒原料基地;掌握贵腐霉菌的接种、分离及纯化,研究酿造贵腐酒的酿酒工艺;开发贵腐葡萄酒产品,并检测该产区的香气特征物质。

　　云南雨热同季,在云南红河州弥勒种植的玫瑰蜜等葡萄品种所酿造的葡萄酒色泽风味与国内外优质葡萄酒无法相比。云 南迪庆种植酿酒葡萄的历史比较悠久,早在 1848 年法国巴黎传教士罗启桢等人到云南迪庆德钦县茨中村建立教堂,便在教堂 附近种植酿酒葡萄和开始酿造葡萄酒。云南省迪庆州自然地理特征是“三山两江一坝”,是“三江并流”自然遗产核心地带。全州平均海拔 3380 米,地形成纵深切割形态,最高 6740 米,最低 1486 米。而德钦县位于北纬 27° 33'44'' 到 29° 15'2'',东经 98° 3'56'' 到 99° 32'20'' 之间,该地区整体属于温带山地季风气候,但由于受海拔和纵深地型影响,形成了垂直农业气候和立体生态环境特征,体现了“一山有四季,十里不同天”的独特气候特征,有利于发展农牧业、旅游业及特色农产品、中成药种植业。自 2001 年迪庆州德钦县开始有组织地规模种植酿酒葡萄,种植地区分布于河谷地带的 5 个乡镇,德钦县是建设绿色生态优质高效酿酒葡萄基地的理想区域。目前,迪庆州德钦县酿酒葡萄产业正处在关键的发展时期。

　　本研究于香格里拉高原贵腐葡萄原料基地进行分离、纯化和培养本土贵腐菌工作,并以人工接种贵腐菌孢子的霞多丽葡 萄为原料酿造贵腐葡萄酒,通过对比人工贵腐葡萄酒与晚采浓甜葡萄酒(未浸染贵腐霉菌的葡萄所酿造的晚采浓甜葡萄酒)的香气成分和香气特征,评价人工贵腐霞多丽葡萄酒的香气特征及其工艺技术的可行性。本研究通过开发贵腐葡萄酒新品类,促进迪庆州德钦县酿酒葡萄产业多元化发展,带动农民增收致富。

　　1. 材料与方法

　　1.1 原料的选择与优化

　　1.1.1 贵腐葡萄基地筛选及建立

　　灰霉葡萄孢 (Botrytis cinerea) 是一种霉菌,其侵染成熟期果实形成适宜酿造天然贵腐葡萄酒的原料,其生成受葡萄品种、地域和小气候等苛刻条件的限制,一般很难获得。在葡萄果实成熟期,只有在温度湿度条件适宜时,夜间迷雾湿度大,而白天晴朗湿度小的特殊干湿交替条件下,灰霉才能对葡萄果实发生适度的侵染,造成葡萄果实在树体上的天然浓缩、脱水,从而提高葡萄的甜度,同时灰霉在生长过程中产生的一些次生代谢物质也进一步丰富了葡萄的风味。目前,世界知名的可造就如此苛刻气候条件的葡萄园产区非常少,像自然贵腐葡萄酒有匈牙利托卡伊(Tokaji)产区的奥苏(Aszú),法国波尔多(Bordeaux)产区的苏玳(Sauternes)等 ,其中匈牙利是贵腐葡萄酒的起源地 。

　　香格里拉高原所处的迪庆州属寒温带山地季风气候,地处横断山脉中段,金沙江、澜沧江贯流其间,怒山、云岭、沙鲁 里山脉由西向东相间排列,南北走向,形成“两江夹一山,两山夹一江”的“W”型深割地貌单元,呈现突出的多样性立体气候及东西坡气候差异。该地区具备适合生产贵腐菌的气候特征和自然条件。

　　酿酒葡萄感染灰霉葡萄孢的适宜气候条件一般为温度 20°C 左右,相对湿度 75% 以上。香格里拉高原金沙江、澜沧江河 谷流域的葡萄园具备这种气候条件和自然条件,适合作为本项目的试验基地,开展贵腐菌的筛选和贵腐葡萄酒的酿造。在初 步筛选小产区的基础上,经过反复论证,确定维西县塔城乡哈达村垦次布威代尔酿酒葡萄园基地 100 亩(1# 基地,海拔2400m)、德钦县佛山乡江坡村霞多丽酿酒葡萄园基地100亩(2# 基地,海拔 2600m)、德钦县云岭乡红坡村霞多丽酿酒葡萄基 地 100 亩(3# 基地,2300m)、德钦县奔子栏镇叶日村东水赤霞珠酿酒葡萄园基地 50 亩(4# 基地,2350m)、德钦县云岭 乡九龙顶赤霞珠葡萄园基地 50 亩(5# 基地,2300m)为本试验的贵腐葡萄基地。

　　1.1.2 贵腐葡萄基地葡萄品种选择

　　选择贵腐葡萄基地的三个酿酒葡萄品种威代尔、霞多丽和赤霞珠为候选品种。分别对以上三个品种的葡萄根据田间气候和贵腐菌发生的时间,选择已发生贵腐菌的葡萄作为样本。进行下一步菌种筛选、分离和培养工作,并做好样本标记。

　　1.2 贵腐菌的筛选、扩培与人工接种

　　1.2.1 贵腐菌的筛选

　　1.2.1.1 气候条件

　　贵腐葡萄基地 1 月份平均气温为 0.5~4.5°C,7-11 月平

　　均气温为 18~24°C。年平均气温为 15.2~16.5°C,年日照时数 1937~1743 h 以上,无霜期为 230~240 d 以上。其中,9~11 月早晚田间湿度较大易发灰霉病,中午以后光照充足,该气候条件适宜于贵腐葡萄的生产。

　　1.2.1.2 土壤条件

　　贵腐葡萄基地的土壤以壤土、沙壤土、褐土为主,土壤全盐含量不高于 3.0 g/kg,ph 不大于 8.5,地下水位不高于 1.5 m。

　　1.2.1.3 环境条件

　　贵腐葡萄基地的环境符合 GB 3095《环境空气质量标准》 和 GB 15618《土壤环境质量标准》标准要求。

　　1.2.1.4 贵腐菌筛选

　　2015年,从五个基地的霞多丽(9个葡萄样品)、赤霞珠(4 个葡萄样品)和威代尔(5 个葡萄样品)合计 18 个类似感染贵腐菌的葡萄样品中筛选贵腐菌(灰绿葡萄孢)。

　　将初选的 18 个菌种,按照贵腐霉菌的有关方法进行分离和培养,根据形态特征进行初步鉴定,其中 1、2、4# 菌落样 品从菌落形态上近似,但 2# 较 1# 生长慢,因分别取自不同的葡萄品种,可能会存在差异,菌种全部保留。5、7# 菌落形态 近似,取自不同的葡萄。8、10# 菌落形态近似,取自不同的葡萄。6、16、17、18# 菌落确定不是灰霉菌,但均取自侵染灰霉 菌的葡萄,菌落予以保存。其余菌落均有各自不同的形态、特征,送到上海生工进行 DNA 测序,以及武汉微生物所再次鉴定,确定 13# 菌种为灰霉菌(灰葡萄孢霉),经形态学和分子鉴定为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。

　　1.2.2 人工提纯与扩培

　　13# 灰霉菌菌种再次经过分离、在 3% 葡萄糖、4% 土豆 汁、0.1%硝酸钾、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁培养基和 26°C、pH 值 5.5、摇床速度 120 r/min 下扩培。

　　1.3 贵腐葡萄酒酿酒工艺优化

　　1.3.1 原料优化

　　参考金其荣等的研究方法,探究人工贵腐菌的接种方法以及人工贵腐酒的酿造工艺。参考陶永胜等的研究方法,研究了 酿酒葡萄经人工侵染灰葡萄孢后所酿贵腐酒的香气特征;参考兰圆圆等的研究方法,对人工贵腐酒的酿造工艺及香气特征物 质的研究。通过模拟贵腐菌的生长条件,采用早、中、晚各三次人工喷洒侵染。当出现菌丝穿透葡萄皮的现象时,将葡萄整 串挂起晾晒。

　　(1)品种选择

　　在现有的霞多丽、威代尔和赤霞珠三个品种中,根据所处的符合贵腐菌生长的自然条件,通过在田间筛选菌种样本对葡 萄进行浸染,形成贵腐葡萄酒的酿酒原料。

　　(2)人工浸染

　　将鉴定和纯化后的贵腐菌菌种配置成菌悬液在即将成熟的葡萄上,1~3 d 后菌种感染葡萄,葡萄自然皱缩,形成人工贵腐 葡萄原料。

　　(3)品质优化

　　三个品种酿酒葡萄浸染后,发现霞多丽葡萄浸染效果最好。以浸染贵腐霉菌较好的霞多丽酿酒葡萄为原料。总糖 ≥ 350 g/L、总酸 6~8 g/L、pH 3.4~3.6、葡萄原料中有其独特风味以及无花果、干果风味。

　　1.3.2 工艺优化

　　贵腐葡萄→进料分选→除梗破碎(二氧化硫、果胶酶)→ 入气囊短期浸渍→压榨取汁→分离清汁(抗氧化剂澄清)→低 温发酵→分离→下胶澄清→离心→过滤→灌装。

　　(1)前处理在输送葡萄桨的同时进行加硫操作,控制总二氧化硫为 60~70 mg/L(针对原料的卫生状况作调整)、并添加 HC 果胶 酶 40 mg/T。(注意:二氧化硫不可与果胶酶接触,不可同时 添加。)

　　经除梗破碎后的葡萄醪直接入气囊压榨机进行压榨取汁,压榨的同时充氮气进行保护,在气囊内葡萄汁短期浸渍果皮 8 h 以上再进行压榨,直接通过热交换器进行降温到 8~12°C,静置 48 h 后进行转罐,去掉罐底沉淀。所有倒罐都在封闭条件下进行。

　　压榨和澄清过程充氮气保护自流汁和压榨汁,防止氧化,直至发酵启动。

　　(2)酵母选择

　　葡萄汁经澄清处理后入罐,将 200 g/T 活化好的 K1 酵母加入葡萄汁内进行发酵。

　　(3)发酵控制

　　发酵启动后,控制发酵温度为 12~15°C。每 4 h 监测一次温度比重,若发现发酵缓慢,加入复合发酵助剂 Fermaid K 以保证发酵正常进行;每天循环 2 次,每次循环体积为 1/3。

　　(4)后处理及灌装

　　酒精度达到 8~11 %vol 时,进行检测和品鉴。降温至 0~5°C 使发酵终止、静置澄清后一次分离原酒,再次添加二氧化硫至游离二氧化硫 30~40 mg/L;立即进行下胶澄清实验,用皂土进行下胶澄清处理后,用碟片离心机进行离心,纸板过滤。过滤后进行低温(5°C左右)满罐贮存,检测指标合格后进行灌装。

　　2. 结果分析

　　2.1 常规理化指标的分析

　　通过来自相同原料基地的葡萄,分别酿制的人工贵腐葡萄酒与晚采浓甜葡萄酒进行理化和香气特征物质对比分析。

　　由表 1 分析,人工贵腐葡萄酒(NW)与晚采浓甜葡萄酒 (SW)相比存在显著差异。NW 酒样的酒度为 8.79 %vol 高于 SW 酒样 0.9 %vol。挥发酸都略高于 1.1 g/L,低于 1.2 g/L。总酸 NW 酒样少 SW 酒样 4 g/L,残糖含量 NW 比 SW 多 19 g/L。

　　2.2 感官分析

　　由图 1 可知,这两款酒样涉及的香气种类主要有 10 种,对于贵腐酒的特征香气如焦糖、蜂蜜、咖啡、橘皮、香料等,在这两款酒中均有呈现。NW 酒样的酸果类、甜果类、花香类、小浆果和柑橘类的 MF 值大于 50%,而 SW 酒样只有酸果类、甜果类、花香类、小浆果四种大于 50%。SW 的甜果类 MF 值为 90.24%,香气强度很明显。NW 的酸果和甜果 MF 值在高于 70%。两款酒烘烤类和香料类香气相比其他几种较低。

　　两款酒的香料类、烘烤类、小浆果三类香气强度基本一 样,SW 的焦糖类、花香类、果脯类略高于 NW。SW 的甜果类香气明显较高。NW 的酸果类、乳香类、柑橘类香气略高于 SW。两款酒呈现的香气强弱趋势大致一样,NW 与 SW 相比协调性更好,没有特别突出的香气。

　　2.3 香气成分分析

　　对人工贵腐葡萄酒和晚采浓甜葡萄酒进行了 GC-MS 香气成分检测,结果如图 2 所示。详细的香气数据结果呈现在表 2。由表2 可知,两款酒样涉及的香气成分有 75 种,包括 11 种高级醇类,3 种 C6 化合物,4 种乙酸酯类,13 种乙醇酯类,2 种其他酯类,7 种苯衍生物,2 种挥发性酚类,10 种萜烯类,1 种去甲类异戊二烯即 C13 类,13 种脂肪酸类,2 种醛酮类,3 种呋喃类,3 种山梨酸类,1 种其他化合物类。NW 检测到 48 种:8 种高级醇类,2种C6化合物类,2种乙酸酯类,6种乙醇酯类,2 种其他酯类,6 种苯衍生物类,2 种挥发性酚类,5 种萜烯类,10 种脂肪酸类,2 种醛酮类,2 种呋喃类,还有 1 种其他化合物。SW 检测到 62 种:10 种高级醇类,3 种 C6 化合物类,4 种乙酸酯类,12 种乙醇酯类,2 种其他酯类,5 种苯衍生物类,2 种挥发性酚类,10 种萜烯类,10 种脂肪酸类,2 种呋喃类,还有 2 种其他化合物。

　　两款酒样中高级醇的含量最高,使葡萄酒呈现明显的醇香、果香和花香。其中,NW 中异丁醇浓度最高(57029.5μg/L),其次为异戊醇(46071.1μg/L)。SW 与 NW 相同,异丁醇的浓度最高(35084.9μg/L),其次为异戊醇(31961.0μg/L)。NW 异丁醇与异戊醇的浓度明显高于 SW。NW 中不含有 1- 辛烯 -3- 醇、庚醇、1- 癸醇。SW 中不含有 2- 壬醇,2- 壬醇会带来苹果、香 蕉、悬钩子、草莓、玫瑰等香气。

　　C6 化合物有异己醇,1- 己醇,(Z)-3- 己烯 -1- 醇,主要给酒体青香、药香、果香。NW 中未检测到 (Z)-3- 己烯 -1- 醇,而且 SW 中 1- 己醇的浓度接近 NW 中含量的两倍。

　　图 2 中两款酒样中的酯类物质含量仅次于高级醇类。SW 中酯类物质的种类与浓度皆多于 NW。SW 中不含 3- 羟基己酸乙酯,这种物质主要带给葡萄酒果香。其中,乙酸乙酯在两款酒中浓度最高,主要香气特征为果香和甜香。NW 与 SW 中乳酸乙酯是酯类的第二大成份,给酒体带来新鲜的气味和香蕉味。乙酸异戊酯的浓度分别为 1574.7μg/L、2964.9μg/L 时可带给酒体稀有水 果和奶油气味。两款酒中其他酯类物质的浓度都低于1000μg/L,给 葡萄酒添加其他的香味,丰富葡萄酒的香气成分。

　　SW 中未检测到乙酸苯乙酯,其为酒体带来花香。苯乙酸乙酯在 NW 中未检测到,主要表现为蜂蜜,玫瑰和果香。苯乙 醇主要表现为花香,在 NW 中浓度高达 70444.4 μg/L,SW 中苯乙醇的含量相对 NW 中的浓度低。

　　两款酒样中挥发性酚类物质为 4- 乙烯基愈疮木酚和 2,4- 二叔丁基苯酚。2,4- 二叔丁基苯酚在两款酒中浓度大于 4- 乙烯基愈疮木酚,4- 乙烯基愈疮木酚香气特征为烟味。

　　萜烯类香气物质橙花醇、罗勒烯、trans- 里哪醇氧化物 ( 呋喃型化合物 )、里哪醇、4- 萜烯醇、3,7- 二甲基 -1,5,7- 辛三烯 -3- 醇、反式 - 罗勒烯醇、L-α- 松油醇、香茅醇、香叶基丙酮主要带给酒体木兰香、丁香味、橙花油、木头等香气。SW 中检测到以上全部萜烯类物质,而酒样NW中只检测出了里哪醇,4- 萜烯醇,L-α- 松油醇,香茅醇四种萜烯类物质。

β- 大马酮只在 SW 中检测到一种物质,主要的香味特征是树皮、桃罐头、烤苹果和干杏味。NW 中没有检测到。

脂肪酸类物质大多会带给酒体脂肪味。其中,辛酸和 n- 癸酸在两款酒中含量较高。辛酸会带来腐败味、刺激味、奶油 和脂肪味,SW 中的含量与 NW 相比相对含量增加了 822.5μg/ L。n- 癸酸会带来脂肪味,SW 中的含量较 NW 低 82.8μg/L。己 酸的相对含量 SW 比 NW 高 1522.7μg/L,而且在两种酒样中己酸的相对含量是较高的,给酒带来奶油、腐败味不愉快的香 气。NW 中 2- 甲基丁酸含量 2664.5μg/L,SW 中未检测到,2- 甲基丁酸会带来羊乳干酪的香气。异辛酸在 NW 中检测到含量为 40.5μg/L,SW 中未检测到。

　　醛酮类有 2- 辛酮呈现牛奶、乳酪、蘑菇的香气和 6- 乙氧基 -6- 甲基 -2- 环己酮表现为薄荷香、樟脑的香气。这两种 香气在 NW 中检测到,在 SW 中都未检测到。

　　呋喃类有糠醛、糠酸乙酯和糠醇。SW 中未检测的到糠醇。糠醇会给葡萄酒带来霉香,甜香,焦糖香,面包香,咖啡香。NW 中未检测到糠酸乙酯,这一物质给酒带来青果香。两款酒都有糠醛,给酒带来甜香、木香、面包香。

　　由于 SW 是成品酒,添加了山梨酸钾作为防腐剂,只在 SW 中检测到了山梨酸类。在 NW 中检测到了 N-(3- 甲基丁 基)乙酰胺。

　　两款酒中高级醇类、苯衍生物类、乙酸酯类和脂肪酸类的浓度较高,均在 10000μg/L。其中,人工贵腐酒(NW)的高级醇类、苯衍生物类、乙酸酯类含量明显大于晚采浓甜葡萄酒(SW),脂肪酸类的含量差异不大。SW 的乙醇酯类 17297.7μg/L,而 NW 中只有 5953.8μg/L,SW 中山梨酸类、挥发性酚类和 C6 化合物类的浓度均高于 1000μg/L。NW 不含山梨酸类,挥发性酚类的含量与 SW 相近,C6 化合物类只有 8000μg/L 左右。NW 呋喃类的含量在 100μg/L 以上,SW 只有 10μg/L 左右,两款酒的差别较大。两款酒的萜烯类含量均在 200μg/L 以上,SW 中的含量高于 NW 中的含量。两款酒样中醛酮类、其他酯类、C13 类的含量少,都在 100μg/L 以下,NW 的醛酮类只有 2.2μg/L。

　　3. 结果与讨论

　　本实验通过在香格里拉高原产区符合贵腐霉菌生长的自然环境下,选择适合人工培育的基地,在自然产生贵腐霉菌的三 个酿酒葡萄品种中,成功筛选出贵腐霉菌(灰绿葡萄孢),通过提纯、扩培和生物学基因鉴定,证实香格里拉高原产区存在贵腐霉菌。利用人工手段浸染霞多丽葡萄原料获得成功,采用此原料酿制人工贵腐葡萄酒,并使用顶空固相微萃取气质联 (GC-MS)分析人工贵腐酒和晚采浓甜葡萄酒(对照)的香气成分和香气特征。结果显示,人工贵腐酒一共检测到了 48 种香气物质,对照检测到了 67 种。通过分析发现人工贵腐酒含有更多种类的 6 类香气化合物,具有典型的 9 种类型香气成分。增加了葡萄酒更加丰富和复杂的香气特征。其代表性特征物质有 2- 壬醇、3- 羟基己酸乙酯、苯乙酮、乙酸苯乙酯、4- 羟基丁酸、2- 甲基丁酸、异辛酸、2- 辛酮和糠醇。其特征香气物质明显,并具有典型性。香格里拉高原产区人工贵腐酒的高级醇类、苯衍生物类、乙酸酯类含量明显大于晚采浓甜葡萄酒,乙醇酯类、呋喃类含量高于晚采浓甜葡萄酒,两款酒的差别较大。

　　本实验可以证实香格里拉高原产区具有贵腐霉菌,并说明可以自然发生,且可以通过人工干预手段,大面积产生贵腐葡萄原料。探索酿制贵腐葡萄酒的酿酒工艺,获得贵腐葡萄酒,为产区酒品的多样性打下坚实基础,充分证实香格里拉产区地域的优势和生态多样性。因本实验是初步实验,对于获取的贵腐霉菌已进行形态分析和基因鉴定,缺乏深入的研究;酿酒工艺的探索和研究在大生产推广和实验中需要进一步细化工艺,更需要反复实验确定最终的特征香气物质。香格里拉高原产区贵腐葡萄酒有待通过品种引进、深入分析浸染的方式、原料的采摘时期和符合本地原料的酿酒工艺,最终确定最佳的品种、工 艺方案和特征物质。