张彦斌 靳志敏 王岩 闫彩霞 张宏博通讯作者 内蒙古自治区食品检验检测中心 呼和浩特 010090

　　第一作者:张彦斌(1983—),男,内蒙古呼和浩特市,微生物检验师(中级),硕士,研究方向:食品质量与安全。

　　通信作者:张宏博,男,(1986—),内蒙古巴彦淖尔市,高级工程师,博士,研究方向:食品质量与安全。

　　基金项目:内蒙古自治区科技重大专项(ZDZX2016016);内蒙古自治区科技创新引导奖励资金项目(2017 年度);内蒙古自治区科技创新引导奖励资金 项目(KCBJ2018068)。

　　摘 要:对豆制品运用改良CTAB法、SDS法提取DNA,能够优化大豆及豆制品的检测。本文选择小黄豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐几种样品,运用改良CTAB法、SDS-PVP法、SDS法、CTAB法、TIANGEN试剂盒法分别提取DNA纯度。结果显示,提取大豆DNA运用改良CTAB法、SDS法提取出质量较好的DNA,纯度较高,豆腐样品中的DNA浓度最 低,研究改良CTAB法、SDS法运用下的PCR产物凝胶电泳,得出扩增正常的模板DNA,显示提取的DNA未被污染,纯度较高。改良CTAB法、SDS法可得出DNA条带。对小黄豆、大豆 MON 89788、豆腐运用SDS法进行实验能够得到更为清晰的基因组DNA条带,完整性更强。SDS法检测适用性较强,较为便捷,可用于大豆及豆制品的实际检测活动。

　　关键词:大豆 MON 89788;转基因检测;SDS法;改良CTAB法

　　引言

　　目前我国民众对转基因食品的生态安全性、食用安全性依然存在一定争议,部分国家对转基因食品要求标签化管理。在 此背景下,运用准确、快速的转基因检测方式,可以保证消费者对大豆相关食品的选择权与知情权。

　　1. 豆制品转基因检测中不同 DNA 提取方法的比较实验设计

　　1.1 材料与试剂

　　本次研究选择从家乐福超市购买的豆腐、小黄豆、大豆油,转基因大豆品种选择从美国分析化学家协会 AOAC 购得 MON 89788 大豆。

　　研究试液选择上海生工生物工程股份有限公司生产的磷酸缓冲盐溶液 (PBS)、0.5Mol/l8.0pH 酸碱度的乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液、pH 酸碱度 8.0 的 CTAB 提取缓冲液、SDS 提取 / 裂解缓冲液、改良 CTAB 提取缓冲液,选择北京 TIANGEN 生物公司生产的 TIANGEN 试剂盒,选择碧云天生物技术公司生产的 RNA 酶 A、蛋白酶 K[1]。

　　1.2 设备与仪器

　　选择美国 BIO - RAD 公司生产的 T100TMPCR 仪,美国 THERMO 公司生产的高速冷冻离心机,常州国华电器有限公司生产的 SHA - B 恒温振荡器,日本岛津公司生产的 UV - 1800 紫外分光光度计,上海天能公司生产的 TANON 6600 凝胶成像仪,上海安亭公司生产的 TGl - 16G 高速离心机,常州国华电器有限公司生产的 HH - 4 数显恒温水浴锅。

　　1.3 DNA 提取方法

　　农业农村部 1485 号公告- 4 - 2010 中的相关规定,运用改良 CTAB 法、SDS - PVP 法、SDS 法进行转基因植物的提取与纯化。按照相应方法中的要求配置抽提缓冲液,结合 TIANGEN 试剂盒说明书的要求配置相关溶液,将提取到的 DNA 放入冰箱,冷藏保存,以便于后续检测运用。见表 1。

　　2. 豆制品转基因检测中不同 DNA 提取方法的比较结果与分析

　　2.1 研究蛋白酶 K、RNA 酶 A 的浓度

　　蛋白酶 K 能够帮助释放大豆及豆制品中的 DNA,能够有效消化包围靶 DNA 含有的蛋白质,因此实验中可以适当增加蛋白酶 K 浓度。ꎮ蛋白酶 K 的浓度与 DNA 纯度之间有一定联系,在 5MG/Ml 蛋白酶 K 浓度或者不添加蛋白酶 K 情况下,得 出的 D260NM/D280NM 值往往低于 1.7,显示大豆中蛋白质污染严重。蛋白酶 K 浓度逐渐提升时,D260NM/D280NM 值逐渐接近 1.8。在蛋白酶 K 浓度高于 20MG/Ml 之后,D260NM/ D280NM 值会再次低于 1.7,又出现了蛋白质污染现象。这主要是由于蛋白酶 K 本身也属于蛋白质,加入浓度过高会造成蛋白质污染。由此本次实验中蛋白酶 K 浓度ꎮ设置为 15MG/ Ml。在提取 DNA 时,若出现 RNA 污染,会对实验造成不良 影响。而 RNA 酶 A 则能够水解 RNA,由此本次实验优化了 RNA 酶 A 的添加浓度的添加 [2]。

　　在 RNA 酶 A 浓度小于等于 4MG/Ml,或者不添加 RNA 酶 A 情况下,得出的 D260NM/D280NM 值往往低于 1.9,显示 大豆中 RNA 污染严重。RNA 酶 A 浓度逐渐提升时,D260NM/ D280NM值逐渐接近1.9。设置8MG/MlRNA酶A浓度,在 RNA酶A浓度逐渐提升时,D260NM/D280NM值能够趋于较为稳定,由此本次研究运用RNA酶A浓度设置为8MG/ Ml。见图 1。

　　2.2 研究并鉴定 5 种方法提取样品的 DNA 纯度、浓度

　　对小黄豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐分别运用改良 CTAB 法、SDS - PVP 法、SDS 法、CTAB 法、TIANGEN 试 剂盒法等提取 DNA 纯度。在 D260NM/D280NM 低于 1.7 时,说明出现蛋白质污染。在 D260NM/D280NM 值大于等于 1.9 情 况下,可见存在 RNA 污染,在 D260NM/D280NM 数值保持在 1.8 上下时,得出的 DNA 纯度较高 [3]。

　　对于小黄豆样品、大豆 MON 89788 样品运用改良 CTAB 法、SDS 法提取的 DNA,具有 1.7-1.9D260NM/D280NM 值。可 见,在提取大豆 DNA 时,运用改良 CTAB 法、SDS 法能够提取出质量较好的 DNA,纯度较高。豆腐在加工过程中需要进行一定的热处理,为深加工产品,加工中会产生一些不同的物质,由此使得 DNA 出现一定的降解。因此本文五种方法运用过程中,提取的 DNA 纯度数值均呈现一定程度的降低。SDS 法运用下 DNAD260NM/D280NM 值得到 1.8 ꎬ,运用其他方法时,得到的 D260NM/D280NM 值在 1.7 上下。依据此分析结果,可知五种方法中,SDS 法能够得到最好的提取效果。大豆油的生产需要经历一定的精炼过程,会在一定程度上损失 DNA,增加了提取难度,由此可运用改良 CTAB 法提取大豆油中的 DNA。

　　分析几种研究方法下对小黄豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐的 DNA 提取浓度,综合分析可知效果最佳的为 SDS法,效果最不理想的为 SDS - PVP 法。其重要原因为 SDS 属于 阴离子去污剂,在高温的实验条件下,能够裂解细胞,离析染色 体,并使得蛋白变性。并且ꎬ SDS 会和多糖、蛋白质等合成复合 物,提升 DNA 得率,并释放核酸。实验中为了得到浓度更高的 DNA,可以适当增加盐溶液浓度、抽提酚溶液与三氯甲烷。

　　实验中添加的 PVP 属于一种高分子表面活性剂,运用中提升了提取反应体系黏稠性,能够吸附研究样品中的部分 DNA,降低 DNA含量。几种样品在运用不同研究方法下,与小黄豆样品、大豆MON89788样品相比,豆腐样品中的DNA浓度最低。其原因之一为豆腐加工过程中在一定程度上破坏了DNA。

　　2.3 豆制品转基因琼脂糖凝胶电泳检测

　　实验中,要求验证大豆 lECTIN 基因研究提取的 DNA 与后续 PCR 检测工作的契合度。对几种研究方法下的不同样品的 DNA 进行 PCR 扩增,分析蛋白质中蕴含的多糖、蛋白质、RNA 情况,杂质的出现会阻碍 PCR 反应,导致假阴性结果出现。分析改 良 CTAB 法、SDS 法运用下的 PCR 产物凝胶电泳情况,得出扩 增正常的模板DNA,显示提取的DNA未被污染,得出较高的纯度。

　　比较不同样品下的 DNA,最终的 DNA 条带具有 118BP 条 带大小。与最终研究产物的片段大小保持一致。由此可见,可以 使用改良 CTAB 法、SDS 法提取 DNA。研究改良 CTAB 法、SDS 法下样品 DNA 完整性凝胶电泳情况,可见,改良 CTAB 法、SDS 法运用下均能够得出 DNA 条带。与改良 CTAB 法相比,对小黄豆、大豆 MON 89788、豆腐运用 SDS 法进行实验能够得到更为 清晰的基因组 DNA 条带,完整性更强。对大豆油的 DNA 提取效果不佳,由此得到的基因组DNA条带不够完整,清晰度不高。出现少量的蛋白质污染,综合以上可知最佳的施行方法为 SDS 法。

　　3. 结果分析

　　实验研究表明,可通过改良CTAB法、SDS法得出 DNA 条带。与改良 CTAB 法相比,对小黄豆、大豆 MON 89788、豆腐运用 SDS 法进行实验能够得到更为清晰的基因组 DNA 条带,完整性更强。琼脂糖凝胶电泳检测最佳的施行方法为 SDS 法。在具体操作过程中,简化操作步骤,减少对基因组 的损伤,降低污染可能性。本次研究应用价值较大。

　　参考文献:

　　[1]赵冰兵,任雯,周秒依,等.叶片直接PCR法在玉米转基因快速检测中的应 用[J].山西农业科学,2019,47(04):11-14.

　　[2]张鸿凯,杨曼,石登红,等.不同DNA提取方法在猕猴桃属植物中的应用 [J].贵阳学院学报(自然科学版),2018,013(001):101-104.

　　[3]邹奕,朱尚明,栗媛,等.样品不同处理方法提取甜菜基因组DNA的比对研究[C]//中国作物学会甜菜专业