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2020-09(下)基于荧光微球免疫层析技术的地塞米松定量检测法

2020-10-28 16:03:55来源: 《中国食品工业》

  刘妍 1 李向丽 1 李晓璐 1* 中山火炬职业技术学院 广东中山 528436

  摘 要:以地塞米松为代表的糖皮质激素非法添加现象,仍然是我国动物源性食品安全的重要隐患。研究通过荧光微球免疫层析技术,对地塞米松进行了定量检测。结果发现,所建立的地塞米松检测方法IC50为0.87 ng/mL,线性范围为0.1~8.4ng/mL(y =-0.18ln x+0.92,R2=0.99)。检测组织样本的最低检出限为0.7μg/kg,平均相对标准偏差<30%(n=6)。使用30%的甲醇水溶液能一步完成提取过程,平均回收率为78%。 

关键词:地塞米松;定量;荧光微球;免疫层析

  地塞米松(图 1 a)作为一种长效的糖皮质激素,具有良好的抗炎 抗过敏作用,被广泛用于动物疾病治疗。然而,一些 研究指出,地塞米松因其促进动物生产功能而被非法滥用。在一些功能食品、保健品甚至是一些中药材中,不法商贩通过非 法添加糖皮质类激素,使消费者在食用后短期内出现一些积极作用,但若长期食用则会引起内分泌失调、致畸、致癌、致突变、水肿、糖尿病等不良反应。在化妆品方面,由于糖皮质类激素可以抑制细胞增生,减少 5- 羟色胺的形成,从而对皮肤有一定的嫩白作用 。但在长期使用后,就会造成人体皮肤变薄、毛细血管扩张和毛囊萎缩,轻度受害者会皮肤会恢复到使用前状态,中度受害者会出现激素依赖性皮炎症状,重度受害者则会造成更严重的后果,比如类固醇性糖尿病、骨坏死和骨质疏松、精神失常、消化性溃疡和高血压等疾病。因此我国农业部 235 号公告中对动物组织中地塞米松的限量做了具体的规定:肌肉为 0.75μg/kg,肝脏为 2g/kg。

  目前动物组织中地塞米松的检测方法主要有高效液相色谱法 [1]、气相色谱 - 质谱法 [2]、液相色谱串联质谱法[3]。虽然色谱方法准确性较高,然而仪器昂贵、操作繁琐、环境要求高。农产品由于流通时间短(往往只有数小时),检测方法如果耗时较长将无法实现餐前拦截。因此,建立相对准确、便宜、快速的地塞米松现场速测方法作为实验室确证方法的补充,有利于完善农产品检测初筛 - 确证的风险防控体系,保证农产品质量安全。

  免疫层析检测技术(Immunochromatographic Assay,ICA) 的快速发展为地塞米松的现场快速检测提供了良好的技术基 础。然而现有的地塞米松免疫层析方法主要基于胶体金标记,虽 然其能直接依靠肉眼观察结果,但是灵敏度较差且定量不准

确,对于检测地塞米松这种具有低限量值的药物有一定的不便性。并且地塞米松是具有限量值的药物,因此需要在量上判断 是否超标,而胶体金的定量结果偏差较大。合成荧光素作为免疫反应的指示物能有效地提高免疫分析信号,与胶体金标记相 比灵敏度可提高 10 ~ 100 倍 [4]。然而,其容易光漂白且易被基质干扰,目前成功的免疫检测产品仍然较少。近年来兴起的荧光微球(fluorescent microspheres,FM)纳米材料为提高免疫层析灵敏度提供了新的解决方案,其通过将荧光素包裹在荧光微球中,避免了基质和荧光素的近距离接触,从而避免了荧光信号的淬灭 [5]。并且该类微球已经商品化,批间稳定,标记方便。本研究采用荧光微球标记的免疫层析技术,实现了地塞米松的定量快速检测。

  1. 材料与方法

  1.1 材料与试剂

  硝酸纤维膜(NC 膜)、荧光硅球垫、样品垫、吸水纸及 PVC 底板(美国 Millipore 公司);FluoSpheres® 氨基修饰的荧光微球(直径 0.2 μm、激发波长 505 nm、发射波长 515 nm)(美国 Thermo 公司);糖皮质激素类标准品(加拿大 TRC 公司)。其他试剂均为国产分析纯。地塞米松羧基衍生物 (图 1 b),地塞米松包被抗原(图 1 c)和抗地塞米松单克隆抗体由深圳市计量质量检测研究院提供。

  1.2 仪器与设备

  图片拍摄设备为华为荣耀 8, 摄像头覆盖美国 BIOTEK 540nm±25nm 滤光片;505nm LED 光源 台湾光宏;XYZ3100 点膜仪(美国 Bio-Dot 公司);试纸条读取仪(深圳市三方圆生物科技有限公司);Milli-Q 水处理系统(美国 Millipore 公司)。

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  1.3 方法

  1.3.1 地塞米松抗体 - 荧光微球偶联物制备

  将免疫微球,EDC,NHS按1:1:1的比例投料,并加入 1000 倍质量的去离子水。活化过夜后,离心去除上清加 入去 pH7.4 的 0.01M PBS 重悬。分别以抗体质量比微球质量 1:10、1:30、1:100、1:200 的投料比混合地塞米松抗体。反应 12 小时后,离心去除上清液,加入复溶液(含 1% BSA、2% 蔗 糖、0.05% PEG 20000、0.1% proclin 300 的 pH7.4 0.01M PBS 溶 液)重悬抗体 - 荧光微球偶联物。

  1.3.3 荧光试纸条的制备

  荧光试纸条结果如图 2 所示。首先将样本垫浸泡于 20 mmol/ L 磷酸缓冲液(pH 7.4,含 1.0% BSA,0.25% Tween-20、1% PVP K-40、0.5% PEG 40000 和 0.1% NaN3)中,于 60 °C干燥 2 h;将 地塞米松包被抗原(2.5 mg/mL)和羊抗鼠 IgG(0. 3 mg/mL)喷涂于 NC 膜上,分别作为 TTX 试纸条检测线(T 线)和质控线 (C 线),于 37 °C真空干燥 12 h。结合垫喷有 TTX 抗体偶联荧光微球,室温真空干燥 12 h。最后将吸水纸、NC 膜、结合垫和经过预处理的样本垫顺序粘贴在 PVC 底板上,用自动切条机切成 4 mm 宽的试纸条,室温条件下真空干燥,备用。

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  1.3.4 定量曲线的建立

  以 T 线荧光信号 /C 线荧光信号(FIT/FIC)为纵坐标,地塞米松标准溶液质量浓度的对数为横坐标,使用 Origin 8.0 建立四参数拟合曲线。

  1.3.5 方法添加回收率选取色谱确证为地塞米松阴性的肌肉和肝脏样品,地塞米松加标量为 1μg/kg 和 10μg/kg,放置过夜。取 1 g 均质的动物组织,加入 6mL 30% 甲醇水溶液(w/w),涡旋震荡 2 min,2000g 离心 5min,取上清液 0.1 mL 滴加至荧光免疫层析试纸的样品垫,10 min 后读取结果。

  1.3.6 真实样品的方法比对

  在市场组织采购样品 100 份(肝脏和肉各 50 份),使用本研究建立的方法和国标 GB/T 20741-2006 畜禽肉中地塞米松残留量测定液相色谱 - 串联质谱法所规定的方法进行对照检测 [23]。

  2. 结果与分析

  2.1 抗体免疫微球标记投料比

  抗体和荧光微球的投料比是制备抗体荧光微球偶联物的关键参数。抗体加入过多,会导致单个微球上带入过多的抗体,检测方法的灵敏度下降。而抗体加入不足,会导致部分微球无法偶联抗体,则免疫层析的背景过高,同样也会导致灵敏度下降。本研究试验了 4 个梯度的投料比制备的抗体 - 荧光微球偶联物。如图 3 所示,抗体和荧光微球的投料比在 1:30 时,荧光免疫层析最为灵敏。

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  2.2 免疫层析反应时间

  层析反应时间是荧光免疫层析的另外一个重要参数。本研究用空白的蒸馏水和 1.6ng/mL 的地塞米松标准溶液做10min 动态反应试验。如图4所示,免疫层析反应在8min时达到平衡,T 线的荧光值与 C 线的荧光比值不发生显著变化。因此,该试纸在反应 8min 后即可进入荧光免疫层析扫描仪读数。

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  2.3 荧光免疫层析方法参数

  FluoSpheres 氨基修饰的荧光微球是 Thermo 公司的商品化微球。据张世伟等报道,该微球制备的抗体 - 荧光微球偶联物在 6 个月常温保存的荧光衰减< 40%,具有良好的稳定性 [24]。根据微球说明书,该微球的激发范围为 450-515nm,最佳激发波长为 505nm,发射波长为 505-580nm,最大发射波 长为 515nm。为避免激发和发色光源的波长交叉引起的高背景,本研究选用 505nm LED 光源作为激发光源,并覆盖 495nm ±20nm 滤光片避免杂光,在光检测器前覆盖 540±25 nm 滤光片消除背景。图 5 展示了在暗室下使用覆盖 495nm ±20nm 滤 光片的 505nm LED 激发,用手机摄像头覆盖 540±25 nm 滤光片的荧光微球免疫层析试纸条观察结果。在 0.1ng/mL 地塞米松 可将试纸条 T 线荧光强度抑制到等同于 C 线,为该试纸的最低检测灵敏度。在 8.4 ng/mL 时 T 线几乎不可见,为线性范围的最高值。

基于上述条件,本研究采用免疫层析荧光读数仪对该试纸条建立标准曲线(图 6),回归方程为 y = - 0.18ln x + 0.92(R2= 0.99)。以线性范围的最低点 0.1 ng/mL 乘以其样本前处理稀释倍数 7 得到其最低检出限为 0.7 μg/kg。糖皮质激素是一类结 构相似的药物家族,表 1 展示了该方法检测其他糖皮质激素的 交叉反应。该方法与醋酸地塞米松、倍他米松、倍氯米松等地 塞米松类似物具有一定的交叉反应。因此,在试纸条检测的样 品为阳性结果需要仪器确证时,需要同时检测表 1 所示有交叉反应的药物。

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  2.5 方法评价

  糖皮质激素属于脂溶性化合物,传统的免疫学检测方法需要使用有机溶剂萃取,吹干,再用 PBS 复溶,前处理非常繁琐,无法满足现场检测的需要 [25]。本研究采用的荧光微球免疫层析方法具有良好的抗有机溶剂能力,可耐受 30% 的甲醇,因此可以使用 30% 的甲醇水进行提取后直接进行免疫分析,平均回收率可达到 78%(表 2)。本方法的在定量上的相对标准偏差和其他免疫学检测方法总体相当,在 20%~30% 之间 [24]。本研究从市场上随机购买肌肉和肝 脏样品各 50 份,分别用本研究建立的方法和国家标准 GB/T 20741- 2006 畜禽肉中地塞米松残留量测定液相色谱 - 串联质谱法进行比对检验。本试纸条结果为地塞米松未检出的 93 个样本,国标法也为地塞米松未检出。本试纸检测结果为阳性的 7 个样本,有 3 个国 标法为地塞米松未检出,其中的一个检出倍他米松,另外两个不符合样品原因不明。4 个荧光微球免疫层析法和国标法均检出的样品定量对比如图 6 所示。对于低含量的样本,荧光微球免疫层析法的定量结果与国标法的吻合度较好。对于高含量的样本,由于甲醇水提取效率的原因,荧光微球免疫层析法的定量结果低于国标法。然而,荧光微球免疫层析方法前处理简单,设备轻便易于携带,实验 环境要求低,作为现场定量方法,具有显著的优势。

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  结语

  以地塞米松为代表的糖皮质激素非法添加现象,目前仍然是我国动物源性食品安全的重要隐患。本研究将新型高灵敏度 荧光探针引入检测地塞米松的免疫层析体系,建立的检测荧光微球免疫检测方法以商品化微球为标记物,制备方便,荧光信 号稳定。配合简单的一步提取前处理方法,整个检测过程仅需 15 min,且无需使用大型设备,提高了地塞米松免疫层析技术 的灵敏度、特异性和稳定性,最终建立针对食品及化妆品中地塞米松荧光免疫层析现场快速检测方法。该技术方法的建立对提高地塞米松检测效率、降低检测成本等具有重要实际意义,并 为食品及化妆品中小分子污染物快速检测方法提供新思路 , 从而弥补了动物源性食品中地塞米松现场快速检测技术的短板。

  参考文献

  [1]闵春艳, 王鸣人, 吴杨, 等. UPLC-MS/MS法检测抗菌乳膏中的痕量地 塞米松和倍他米松[J]. 药物分析杂志, 2017,37(7): 1248-1255.

  [2]安彦,王卫,唐素芳等.顶空毛细管气相色谱法测定地塞米松磷酸钠有机 溶剂残留[J].天津药学,2010,22(4):12-14.

  [3]裴昆, 刘荷英, 左丽平, 等. 液相色谱-串联质谱法同时检测消字号产品中的 地塞米松和氯倍他索丙酸酯[J]. 中国卫生检验杂志, 2017, 27(21): 3071-3076.

  [4]Xu D, Wu X L, Li B, etal. Rapid detection of Campylobacter jejuni using fluorescent microspheres as label for immunochromatographic strip test[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(2): 585-591. DOI:10.1007/s10068-013-0118-5.

  [5]Zhang X Y, Wen K, Wang Z H, et al. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based fluorescent microsphere immunochromatographic test strip assay for detecting aflatoxin M1 in milk[J]. Food Control, 2016, 60: 588-595. DOI:10.1016/ j.foodcont.2015.08.040.



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