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2020-09(上)QuEChERS 前处理 UPLC-MS/MS(液质联用)法测定水产硝基呋喃代谢物

2020-10-15 12:32:27来源: 《中国食品工业》

  摘要:本文实验中建立了一种用QuEChERS前处理,用UPLC-MS/MS测定水产中硝基呋喃代谢物的测定方法。结果表明:在0.5~10.0ng/mL范围内线性关系良好,r均大于0.995;加标回收率范围在83.2%~108.9%,相对标准偏差(RSD)在2.2%~8.4%。实验证明该方法具有过程简单、灵敏度高、回收率好等优点,可为水产中硝基呋喃代谢物的快速检测提供方法依据。

  引言

  硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基呋喃结构的广谱抗菌药物,具有广谱抗菌作用,被广泛应用于医药、畜牧及水产养殖中防治细菌感染疾病。[1]但该类药物半衰期很短,在动物体内能迅速代谢,而与蛋白结合的代谢物在生物体内能长期稳定残留,并具有潜在的致畸、致癌和诱导机体产生突变的作用。[2]中华人民共和国农业农村部公告第250号将硝基呋喃列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》。

  硝基呋喃类药物主要包括呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮,它们代谢物分别是5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基-2-内酰脲(AHD)和3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ),这些代谢产物和蛋白质结合比较稳定,能在生物组织中存留较长时间,故利用代谢物的检测可以反映硝基呋喃药物的残留状况。[3]

  畜禽及水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法主要有免疫胶体金法、液相色谱法和液质联用法等。监测动物性食品中残留的硝基呋喃类代谢物,目前最常用液质联用法,其前处理步骤相对简单、杂质干扰少,能够比较准确地对硝基呋喃类代谢物进行定性和定量分析。[4]

  1 材料与方法

  1.1 仪器与设备

  Waters Xevo TQ-S Micro三重四级杆质谱仪(配有Acquity UPLC超高效液相色谱仪及电喷雾离子源,美国Waters公司),SIGMA高速冷冻离心机(美国SIGMA公司);Milli Q超纯水系统(美国Millipore公司);IKA刀式研磨仪、IKA旋转蒸发仪、涡旋振荡器(均为美国IKA)。

  1.2 材料与试剂

  AMOZ、SEM、AHD、AOZ及其同位素内标D5-AMOZ、13C15N-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ的对照品(纯度≥98%,A ChemTek, Inc和北京曼哈格公司);甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯,默克公司);2-硝基苯甲醛(纯度99%,aladdin公司);盐酸、磷酸氢二钾、氢氧化钠、二甲亚砜(均为分析纯)。

  1.3 实验方法

  1.3.1 标准溶液配制

  分别准确称取硝基呋喃类代谢物标准品,用甲醇稀释,制备混合基质标准校准溶液使最终样液中四种硝基呋喃代谢物的浓度分别为0.5,1.0,2.0,4.0,10.0ng/mL,同时加入四种硝基呋喃代谢物内标物(100ng/mL)100uL。

  1.3.2 样品前处理

  水解及衍生鱼肉组织先经研磨仪绞碎并使之均匀化,称取2g试样于50mL塑料离心管中,加入硝基呋喃代谢物内标物(100ng/mL)100uL,再加入0.2mol/L盐酸8mL,衍生剂0.05mol/L衍生剂0.5mL,混匀,涡旋1min,置于37℃恒温水浴振荡(避光)16h。

  净化:将经水解、衍生后的样品溶液取出后,加入0.5mol/L磷酸氢二钾溶液1mL,用2.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.0~7.5,再加入10mL乙腈,加入QuEChERS萃取盐包,涡旋1min,使其充分混合,8000r/min离心5min,取离心后的上清液6mL加入QuEChERS净化管中,涡旋1min,8000r/min离心5min,取上清液5mL,在40℃条件下旋蒸至近干,用20%乙腈溶液复溶残渣并定容至1mL,经0.22μm滤膜过滤,上机。

  1.3.3 仪器条件

  (1)色谱条件

  色谱柱:Waters Acquity BEH C 18(100mm×2.1mm,1.7μm);柱温:35℃;流速:0.2mL/min;进样量10μL;流动相:A相为乙腈,B相为0.1%甲酸水溶液;梯度洗脱程序0~3.00min,20%~50%A;3.00~6.00min,50%A;6.01~8.00min,20%A。

  (2)质谱条件

  离子化模式:电喷雾离子源ESI,正离子模式;多反应监测(MRM)检测模式;毛细管电压1.0kV;脱溶剂气温度350℃;脱溶剂气流量650L/min。

  结果与分析

  2.1 标准曲线配制的确定

  四种硝基呋喃代谢物的分子量均在75~201g/mol之间,离子化效率较低,所以必须在酸性条件下进行衍生,标准曲线的制定也要按照样品前处理的步骤,进行衍生。

  2.2 质谱条件的确定

  将浓度为 300ng/mL 的硝基呋喃类药物以流动注射的方式,在正离子模式下对质谱参数毛细管电压、锥孔电压以及碰撞能量等进行调谐优化。四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物多反应监测质谱参数优化结果如图1所示。

图 1 四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的质谱分析参数(* 表示定量离子

1602736694(1)

  2.3 方法学验证

  2.3.1 方法的线性范围及检出限

  本实验采用溶剂加标制备混合标准溶液的方式,按上述前处理方法,向5个离心管中分别加入适量四种硝基呋喃混合标准溶液,使最终样液中四种硝基呋喃代谢物的浓度分别为0.5,1.0,2.0,4.0,10.0ng/mL,同时加入四种硝基呋喃代谢物内标物(100ng/mL)100uL,以混合标准溶液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标制,建立标准工作曲线。结果表明,四种硝基呋喃代谢物在0.5~10.0ng/mL范围内线性关系良好,相关系数r均在0.995以上(图2)。以3倍信噪比(S/N>3)计算检出限为0.1μg/kg,以10倍信噪比(S/N>10)计算定量限为0.25μg/kg。

图 2 四种硝基呋喃代谢物的标准曲线及相关系数表

image.png

  2.3.2 回收率和精密度

  选取阴性鱼肉,按照前处理方法,分别添加不同量的混合标准溶液(添加水平分别为0.5、1.25、2.5μg/kg),每个浓度设6个平行样,分别计算回收率和精密度,来验证方法的准确性,结果表明四种硝基呋喃代谢物的平均回收率在83.2%~108.9%,相对标准偏差(RSD)在2.2%~8.4%。实验结果见图3。

image.png

  3 结语

  本实验采用衍生、QuEChERS 前处理,超高效液相色谱—串联质谱技术,建立了水产品中四种硝基呋喃代谢物残留的检测方法。结果表明,该前处理方法快速方便,大大减少了试剂用量。本方法线性、回收率、精密度均满足检测要求,可用于水产品质量安全监测时大批量样品中硝基呋喃代谢物的快速筛查。(珠海市食品药品检验所 彭芸


参考文献:

[1]辛少平、邓建朝、杨贤庆等。高效液相色谱法测定硝基呋喃类药物代谢物及其在对虾体内的代谢[J]。食品科学,2014,35(24):151-157。

[2]邢丽红、孙伟红、彭吉星等。液相色谱-串联质谱法测定贝类组织中硝基呋喃类代谢物残留量[J]。环境化学,2019,38(02):287-296。

[3]唐红梅、曾芳、李成洪。食品中硝基呋喃类药物及其代谢物残留检测的研究进展[J]。食品安全质量检测学报,2016,7(10):3952-3959。

[4]赵东豪、黎智广、王旭峰等。高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物的优化研究[J]。南方水产科学,2015,11(06):58-64。



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